افزایش مقاومت به پوسیدگی خاکستری (Botrytis cinerea) با استفاده از بیانEDT151 -پپتید ضدمیکروبی غنی از سیستئین- در گیاه Nicotiana benthamiana
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
همه موجودات زنده انواع مختلفی از پپتیدهای ضدمیکروبی را تولید می‌کنند. این پپتیدهای کوچک آمفی پاتیک، تنوع ساختاری بالایی دارند و در برابر باکتری‌ها، قارچ‌ها و ویروس‌ها فعالیت ضدمیکروبی نشان می‌دهند. این پپتیدها با غشای میکروب‌ها واکنش داده و سبب ایجاد سوراخ و نشت مواد سلولی و در نهایت جلوگیری از رشد بیمارگرها می‌گردند. در این تحقیق، EDT151 در گیاه Nicotiana benthamian بیان شد تا فعالیت ضدقارچی این پپتید در برابر B. cinerea ارزیابی گردد. این پپتید بوسیله جهش در ژن ard1 در ناحیه کاتیونیک یا هیدروفوبیک پپتید ایجاد می‌شود. ARD1 از لارو شب پره Archeoprepona demophoon جدا شده و آنالوگ هلیومیسین است. هلیومیسین 44 اسید آمینه دارد و یکی از اعضای خانواده پپتیدهای ضدمیکروبی غنی از سیستئین با ساختار متراکم دارای چین خوردگی‌های بتا در حشرات می‌باشد. به عبارت دیگر از نظر ساختمانی دارای پیچش‌های آلفا است که با دو اتصال دی سولفیدی به صفحات بتا متصل می‌گردد و از همولنف کرم جوانه تنباکو Heliothis virescens جدا شده است. این پپتیدها همولوگ دفنسین‌های گیاهی هستند. ژن edt151 بر اساس توالی طراحی شده توسط لاندن و همکاران (2004) سنتز شد. توالی سیگنال پپتید آپوپلاستیک از پروتئینPR1a به ابتدای این توالی متصل گردید. این سیگنال پپتید سبب می‌شود که پپتید مورد نظر به آپوپلاست و خارج سلول هدایت شده و از تجزیه شدن و تخریب جلوگیری گردد. به منظور افزایش کارایی بیان ژن با استفاده از جدول فراوانی کدون‌ها در گیاه N. benthamiana و کدون‌های مربوط به هر اسیدآمینه، توالی کدن‌های ژن اصلاح گردید. DNA 135 جفت بازی کد کننده edt151 با قطعه DNA 90 جفت بازی کد کننده سیگنال پپتید آپوپلاستیک ژن PR1a جفت گردید و با استفاده از واکنش In-Fusion درون کلون صفر pDONR-zeo قرار گرفت. واکنش Gateway LR clonase برای وارد کردن ژن edt151 درون وکتور بیان استفاده گردید. الایزا، Reverse-transcriptase-PCR و Real Time PCR و وسترن بلات برای تایید حضور، رونویسی و بیان ژن edt151 درون گیاه استفاده گردید. اسپورهای B. cinerea با عصاره گیاهان تلقیح شده با ApoSP/edt151 به مدت 12 ساعت تیمار گردید. پس از این مدت با بررسی اسپورها توسط میکروسکوپ نوری مشخص شد اسپورها نسبت به نمونه‌های کنترل متورم شده و در بعضی موارد نشت سیتوپلاسمی مشاهده می‌گردد. آزمون زیست سنجی ضدقارچی تایید کرد که این پپتید میزان جوانه زنی اسپورها را کاهش می-دهد هرچند آن را به به طور کامل متوقف نمی‌کند. بعلاوه آزمایش‌های انجام گرفته روی برگ‌های بریده گیاهان تراریخته و گیاهان شاهد نشان داد که گیاهان تراریخته مقاومت نسبی به قارچ B. cinerea نشان می‌دهد.
کلیدواژه ها