خالص ‏سازی و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی تریپسین معده‏ ی میانی شب پره هندی Plodia interpunctella

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

دانشگاه تربیت مدرس

سالانه میلیون‏ها تن از محصولات استراتژیک انباری مانند غلات، حبوبات، میوه‌های خشک، مغزی‌جات و مواد غذایی فرآوری شده در کشور‏های در حال توسعه از بین رفته و باعث خسارت‏های اقتصادی فراوان می‏شوند. از میان 500 گونه سوسک‏ها و شب پره‏های آفات گیاهی، شب پره هندی Plodia interpunctella (Hübner)، مهم‏ترین آفت و عامل اصلی نابودی محصولات انباری می‏باشد. لارو در حین تغذیه، اقدام به تولید تار ابریشمی می‌کند که مانند حصیر ضخیم، روی سطح غذا قرار می‌گیرد. اخیرا، تلاش‏هایی برای استفاده از مهارکننده‏های آنزیمی گوارشی مانند مهارکننده‏های پروتئازی و آمیلازی جهت کنترل خسارت آفات انجام شده است. پروتئازها، اسیدهای آمینه لازم برای حشرات آفت را از طریق هیدرولیز کردن پروتئین‏های موجود در غذای خورده شده، جهت رشد و نمو را فراهم می‏کنند. از میان پروتئاز‏های گوارشی راسته بالپولکداران، تریپسین گزینه مناسبی برای مهار می‏باشد. تریپسین، سرین پروتئازی است که روی باقیمانده‏های آرژنین یا لیزین عمل می‏کند. به همین جهت، آنزیم تریپسین شب پره هندی جهت تعیین خصوصیات بیوشیمیایی و توالی DNA مورد مطالعه قرار گرفت. پس از تایید بیان ژن تریپسین از طریق آزمون رونوشت برداری معکوس و تعیین توالی DNA، آنزیم تریپسین لاروهای سن پنجم از طریق کروماتوگرافی تعویض یونی و با استفاده از دستگاه FPLC خالص سازی شد. برای اطمینان از تخلیص آنزیم تریپسین، فراکشن مورد نظر روی ژل SDS-PAGE و زایموگرام برده شد که نتایج حاکی از تخلیص کامل آنزیم مورد نظر داشت. پروفایل دمایی آنزیم نشاندهنده‏ی حداکثر فعالیت آنزیمی در دمای 50 درجه سلسیوس و پروفایل pH بیانگر حداکثر فعالیت این آنزیم در pH=11 می‏باشد. جهت محاسبه‌ی پارامترهای سینتیکی،دامنه‏ای از غلظت‏های مختلف سوبسترای اختصاصی تریپسین (BAPNA)برای رسم نمودار Michaelis-Menten و متعاقب آن نمودار Lineweaver-Burk بدست آمد. دامنه مناسب غلظت سوبسترا بین 0.1 تا 0.001 میلی‏مولار بود و نتایج نشان داد که مقادیر Km و Vmax این آنزیم در معده‏ی میانی لاروهای سن پنجم شب پره هندی به ترتیب برابر 5.3 ± 0.6µM و 31 ± 1.3nmol.min-1.mg-1 می‏باشند. بررسی اثر یون‏های فلزی مختلف روی میزان فعالیت تریپسین تخلیص شده‏ی نشان داد که با افزودن Cu2+ و Mn2+فعالیت آنزیم مهار شد، در حالیکه تریپسین فعالیت خود را در حضور Li+ و در غلظت بالا حفظ نمود. همچنین جهت مطالعه‏ی اثر مهارکننده‏های مختلف روی میزان فعالیت تریپسین تخلیص شده شب‏پره هندی، از TLCK (به عنوان مهارکننده‏ی برگشت ناپذیر تریپسین)، PMSF (به عنوان مهارکننده‏ی برگشت پذیر سرین پروتئازها)، EDTA (به عنوان کلات کننده برگشت پذیر متالوپروتئازها) و Iodoacetic acid (به عنوان مهارکننده‏ی برگشت ناپذیر سیستئین پروتئازها) استفاده شد که نتایج حاکی از مهار فعالیت آنزیم به طور کامل در حضور TLCK و PMSFداشت. از نتایج چنین بر می‏آید که جهت یافتن مهارکننده‏ای مناسب، اطلاع از ویژگی‏های بیوشیمیایی آنزیم برای طراحی مهارکننده‏ای مطلوب و بررسی برهمکنش‏های آنزیم با مهارکننده‏های مختلف ضروری به نظر می‏رسد.

شب پره هندی؛ تریپسین؛ خالص‏سازی؛ ویژگی‏های بیوشیمیایی؛ مهارکننده پروتئازی