تفکیک سریع دو گونه از کنه‌های تارتن خسارت‌زا در گلخانه‌های شهرستان مشهد، Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) و Tetranychus turkestani، با استفاده از روش Multiplex PCR
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
کنه‌های تارتن جنس Tetranychus Dufourمهمترین کنه‌های گیاهخوار هستند. تاکنون بالغ بر 150 گونه از این جنس در دنیا شناسایی شده است که برخی از آنها آفات مهم مزارع، باغات، جنگل‌ها و مراتع و در مواردی از اهمیت اقتصادی بالایی برخوردار هستند. با وجود اینکه سیستماتیک این جنس به‌طور گسترده‌ای مطالعه شده است، اندازه کوچک این کنه‌ها و تعداد محدود صفات تشخیصی، تفکیک مورفولوژیکی آنها را بسیار مشکل می‌کند. اغلب گونه‌های جنس تترانیخوس از نظر مورفولوژیکی مشابه و فقط شکل اندام تناسلی خارجی نر )آدیاگوس) در آنها متفاوت است. هم‌چنین، کلیدهای شناسایی بر ویژگی‌های افراد بالغ تکیه می‌کنند و قابل استفاده برای شناسایی مراحل نابالغ نیستند. در این تحقیق، قابلیت به‌کارگیری روش multiplex PCR به‌منظور شناسایی دو گونه تترانیخید، Tetranychus urticae Koch و Tetranychus turkestani Ugarov and Nikolski، که اغلب در گلخانه‌های مشهد یافت می‌شدند مورد بررسی قرار گرفت. هرچند تاکنون روش‌های تشخیصی متعددی برای شناسایی گونه‌های Tetranychus مورد استفاده قرار گرفته‌اند، این اولین بار است که یک پروتوکول تک‌مرحله‌ای multiplex PCR به‌منظور تفکیک هم‌زمان این دو گونه مورد استفاده قرار گرفته است. در مقایسه با سایر روش‌های مولکولی، به‌کارگیری multiplex PCR در شناسایی گونه‌ها به‌طور قابل توجهی افزایش یافته است به این دلیل که اجازه می‌دهد چندین قطعه DNA به‌طور هم‌زمان در یک واکنش تکثیر شوند. multiplex PCR تک‌مرحله‌ای طراحی شده، بر اساس ژنcytochrome c oxidase subunit 1 (COI)، سریع، قابل اطمینان، دقیق و ساده است. تمام مراحل پروتوکول شناسایی (شامل استخراج DNA، PCR و الکتروفورز) می‌تواند در حدود چهار ساعت تکمیل شود. به‌منظور استخراج سریع و اقتصادی DNA، فقط یک عدد نمونه تترانیخید در لوله اپندورفml 1.5 حاوی ml20 آب مقطر استریل خرد شد که به‌عنوان منبع DNA مورد استفاده قرار گرفت. پس از طراحی دو پرایمر اختصاصی مستقیم و یک پرایمر عمومی معکوس با استفاده از Primer Premier 5 (Perimer Biosoft International, Palo Alto, CA) و بهینه‌سازی دمای اتصال، عملکرد پرایمرها مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج نشان داد که DNA تکثیر شده حاصل از واکنش multiplex PCR برای T.urticae وT.Turkestani قادر است روی ژل الکتروفورز تشکیل باندهایی بدهد که از نظر اندازه طول جفت بازها متفاوت هستند (740bp و 950bp، به‌ترتیب برای T.urticae و T.Turkestani)، که به شناسایی دو گونه بر اساس اندازه قطعه PCR حاصل منجر می‌‌شود. زمانی که مخلوطی متشکل از DNA هر دو گونه مورد استفاده قرار گرفت، الگوی باندهای حاصل قادر به تفکیک گونه‌ها بود. علاوه بر این، آزمایش‌ها نشان دادند که مراحل نابالغ کنه‌ها نیز می‌توانند به‌خوبی توسط این روش تفکیک شوند. برای اطمینان از اختصاصی بودن واکنش برای دو گونه فوقالذکر، گونه دیگری از جنس Tetranychus (T.neocaledonicus)، در واکنش فوق مورد استفاده قرار گرفت. راندن محصول PCR روی ژل، باند قابل مشاهده‌ای ایجاد نکرد که نشان دهنده اختصاصی بودن آغازگرهای طراحی شده برای گونه‌های T.urticae و T.turkestani بود.
کلیدواژه ها