همسانه سازی و بیان ژن پروتئین فعال کننده رونویسی جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی(TYLCV-[Ab])در باکتری E. coli
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی(TYLCV-[Ab]) عامل مهمترین بیماری مزارع گوجه فرنگی در ایران است. TYLCV-[Ab] یک سویه شدید از TYLCV است که هر ساله خسارت زیادی را به این محصول وارد می کند. ژنوم این ویروس یک مولکول دی ان ای تک رشته ای حلقوی است که دارای 6 چارچوب خوانش می باشد. چارچوب خوانشC2 کد کننده ی پروتئین فعال کننده رونویسی (Transcriptional activator protein, TrAP) است که نقش مهمی در فعالسازی رونویسی چارچوب های خوانش باز رشته ویروسی دارد. در این پژوهش ژن پروتئین C2 با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی که حاوی جایگاه برشی آنزیم های BamHI و HindIII به ترتیب در انتهای '5 آغازگرهای ویروسی و مکمل بود، در واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) تکثیر شد. محصول PCR باندازه تقریبی 400 جفت باز به وسیله کیت QIAquick PCR Purification Kit خالص سازی و در ناقل pTZ57R/T همسانه سازی شد. پلاسمید نوترکیب حاصل (pTZTYLCV-C2)، به سویه DH5α باکتری Escherishia coli انتقال داده شد. پس از کشت باکتری به مدت یک شب در دمای ̊C37، دی‌ان‌ای pTZTYLCV-C2 استخراج و صحت همسانه های صحیح با واکنش هضم آنزیمی و تعیین ترادف ژن C2 وارد شده به پلاسمید تائید شد. اندازه دقیق ژن C2، 404 جفت باز تعیین شد. میزان تشابه ترادف ژن C2 وارد شده با ترادف ژن C2 TYLCV-[Ab] %99 تعیین شد. ژن مربوطه پس از هضم آنزیمی با آنزیم-های برشی BamHI و HindIII از pTZTYLCV-C2 بازیابی و به ناقل بیان pET28 وارد شد. پلاسمید نوترکیب حاصل ( pETTYLCV-C2) به سلول‌های باکتری E. coli سویه DE3 منتقل گردید و به مدت یک شب بر روی محیط LB جامد حاوی 100 میکروگرم/ میلی لیتر آمپیسیلین و 25 میکروگرم/ میلی لیتر کانامایسین کشت داده شد. صحت سازه pETTYLCV-C2 با واکنش هضم آنزیمی پس از خالص سازی دی ان ای پلاسمید از کلنی‌های رشد یافته صورت پذیرفت. سازه pETTYLCV-C4 مجدداً با استفاده از روش شوک حرارتی به سلول‌های باکتری E. coli سویه DE3 منتقل گردید و بیان TrAP با استفاده از غلظت های مختلف IPTG القا گردید. بیان TrAP با تشکیل یک باند قوی در جایگاه 19 کیلودالتون که با وزن تخمین زده شده TrAP تطابق داشت در ژل الکتروفورز SDS-PAGE به اثبات رسید. بیشترین میزان تولید پروتئین با غلظت ۷۵/۰ میلی مولار IPTG، دمای 37 درجه سانتیگراد و ۳ ساعت پس از القا مشاهده شد. TrAP بیان شده در E. coli می تواند برای تهیه ی آنتی بادی با خلوص بالا به منظور انجام مطالعات اپیدمیولوژیکی، عملکرد ژن مربوطه از جمله نقش سرکوبگری آن و برهمکنش احتمالی آن با سایر پروتئین های بیمارگر و پروتئین های میزبان مورد استفاده قرار گیرد. با روشن شدن نقش سرکوبگری این پروتئین می توان از آن در مدیریت بیماری ناشی از این بیمارگر استفاده کرد.
کلیدواژه ها