همسانه‌سازی و بیان ژن پروتئین همراه با همانند سازی (Rep) جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه-فرنگی در باکتری Escherichia coli
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
بیماری پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی از مهم‌ترین بیماری‌های ویروسی مزارع گوجه‌فرنگی در نواحی گرمسیری و نیمه‌گرمسیری جهان و ایران است. عامل این بیماری ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی (TYLCV) است. TYLCV متعلق به جنس Begomovirus از خانواده Geminiviridae می‌باشد. این ویروس توسط سفیدبالک Bemesia tabaci به طریق پایا انتقال می‌یابد. جدایه ایرانی TYLCV (TYLCV-[Ab]) یک سویه شدید با خسارت زیاد در ایران است. ژنوم TYLCV-[Ab] تک‌بخشی است و دارای شش چارچوب خوانش باز می‌باشد. چارچوب خوانش باز C1، پروتئین همراه با همانندسازی ((Replication associated protein, Rep با وزن مولکولی 41 کیلودالتون را کد می‌کند. Rep یک پروتئین چندعملی (multifunctional) است و وجود آن برای همانندسازی ویروس در سلول میزبان ضروری است. در مطالعه حاضر ژن C1 TYLCV-[Ab] بوسیله یک جفت آغازگر اختصاصی ویروس که به ترتیب حاوی آنزیم‌های برشی BamHI و HindIII در انتهای '5 آغازگرهای ویروسی و مکمل بودند در واکنش زنجیره‌ای پلی مراز تکثیر شد. محصول PCR(1070 جفت باز) پس از خالص سازی با استفاده از کیت QIAquick PCR Purification Kit، در ناقل pTZ57R/T همسانه‌سازی گردید تا پلاسمید نوترکیب (pTZTYLCV-C1) حاصل شود. جهت تأیید صحت وجود ژن مورد نظر در pTZTYLCV-C1، آزمون restriction enzyme analysis توسط آنزیم های محدود کننده BamHI و HindIII انجام شد و ژن C1 وارد شده به ناقل تعیین ترادف گردید. میزان تشابه آن با ترادف ژن C1 جدایه TYLCV-[Ab]، 99 درصد تعیین شد. ژن مورد نظر از pTZTYLCV-C1 بازیابی و به ناقل بیان pET23a انتقال یافت. ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب حاصل pETTYLCV-C1 به باکتری Escherichia coli سویه DE3 به روش شوک حرارتی انجام شد. آزمون restriction enzyme analysis مجدداً جهت تأیید صحت همسانه‌های نوترکیب pETTYLCV-C1 انجام شد. باکتری حاوی pETTYLCV-C1 در محیط LB حاوی آمپیسیلین (100 میکروگرم/میلی‌لیتر) و کانومیسین (25 میکروگرم/میلی-لیتر) کشت داده شد و بیان Rep با استفاده از IPTG القا گردید. کشت غیر القا شده نیز در همین شرایط ولی بدون IPTG به عنوان کنترل رشد داده شد. پروتئین سلول باکتری استخراج و در آزمون الکتروفورز با استفاده از ژل پلی‌اکریل آمید و سدیم دودسیل سولفات بررسی شد. یک باند قوی پروتئین با وزن مولکولی حدود 41 کیلودالتون که با وزن تخمین زده شده Rep تطابق داشت در ژل مشاهده شد. بیش‌ترین میزان تولید پروتئین با غلظت 75/0 میلی‌مولار IPTG در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 3 ساعت پس از القا مشاهده شد. نتیجه این تحقیق نشان داد ژن C1 ویروس پیچیدگی برگ زرد گوجه فرنگی در سیستم باکتریایی قابل بیان است. با استخراج و خالص-سازی این پروتئین می‌توان از آن در تولید آنتی‌بادی با خلوص بالا و استفاده از آن در آزمون‌های سرولوژیکی از جمله الیزا برای تشخیص ویروس استفاده کرد. هم‌چنین می‌توان از این پروتئین در مطالعات اپیدمیولوژیکی، مطالعه عملکرد ژن مربوطه و شناسایی نقش‌های این پروتئین و برهم‌کنش آن‌ها با سایر پروتئین‌های ویروس و میزبان استفاده نمود.
کلیدواژه ها