بیان ژن پروتئین پوششی یک جدایه ایرانی ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی در Escherichia coli

عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران

یکی از مهمترین روش های تشخیص ویروس های بیماری زا، استفاده از روش های سرولوژیکی مبتنی بر الایزا با تکیه بر آنتی بادی های اختصاصی است. تهیه این آنتی بادی ها با روش های سنتی طاقت فرسا و تامین آنها از منابع خارجی هزینه بر و مشکل است. از جمله روش های جایگزین برای تهیه آنتی بادی های اختصاصی که با پیشرفت تکنولوژی دی ان آ نوترکیب حاصل شده است، بیان پروتئین مورد نظر در برخی از باکتری ها از جمله باکتری Escherichia coli و تزریق آن به حیوان خونگرم است. به منظور تهیه آنتی بادی نوترکیب علیه ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی (PLRV) که از نظر اقتصادی از مهمترین ویروس های سیب زمینی بوده و حضور یا عدم حضور آن در اکثر طبقات بذری این محصول حائز اهمیت است، ابتدا جدایه های این ویروس از مزارع تولید بذر سیب زمینی در استان های اردبیل، همدان و آذربایجان شرقی جمع آوری شد. آلودگی نمونه ها به ویروس با آزمون های الایزا و استفاده از آنتی بادی های اختصاصی ویروس (اگدیا، آمریکا) تایید شد. دو جفت آغاز گر اختصاصی یونیورسال برای تکثیر قطعه 1067 نوکلئوتیدی حاوی قطعه 627 نوکلئوتیدی ناحیه ژنومی مربوط به پروتئین پوششی ویروس بر اساس توالی های ثبت شده آن از نقاط مختلف دنیا از جمله آسیا، اروپا و کانادا و با استفاده از نرم افزارهای آنلاین ClustalW و Primer3 طراحی شد. قطعه مورد نظر از تعداد شش، چهار و یک جدایه به ترتیب از استان های همدان، اردبیل و آذربایجان شرقی تکثیر و توالی یابی شد. پس از مقایسه توالی های بدست آمده، توالی غالب در بین جدایه ها (جدایه ای از استان اردبیل) انتخاب و در ناقل pTG-19T (شرکت سیناکلون) همسانه سازی شد. صحت همسانه نوترکیب حاصل (pTG-PLRV-CP) از طریق تعیین ترادف ژن وارد شده مورد تایید قرار گرفت. برای بیان توالی مذکور از ناقل بیان pET28 دارای دنباله هیستیدین در ناحیه 5' استفاده شد. قطعه مورد نظر در ناقل همسانه سازی ابتدا با آغازگرهای اختصاصی دارای سایت های برشی HindIII و KpnI به ترتیب در انتهای 5' آغازگرهای فوروارد و مکمل تکثیر و سپس با همین آنزیم ها هضم شد. قطعه هضم شده در ناقل بیان هضم شده با این آنزیم ها وارد شد. پلاسمید نوترکیب بدست آمده (pET-PLRV-CP) به باکتری منتقل گردید. در نهایت بیان پروتئین پوششی با استفاده از ترکیب IPTG در باکتری القا شد. استخراج پروتئین پوششی بیان شده با استفاده از رزین Ni-NTA انجام شد. آزمون لکه گذاری وسترن با استفاده از آنتی بادی anti-His از بیان باند حدود 24 کیلودالتونی مربوط به پروتئین پوششی ویروس PLRV حکایت داشت. پروتئین بیان شده می تواند برای تولید انبوه آنتی ژن و نهایتا تولید آنتی بادی نوترکیب، شناسایی PLRV در طبقات مختلف بذری سیب زمینی و مطالعات برهمکنش ویروس-میزبان مورد استفاده قرار گیرد.

ویروس پیچیدگی برگ سیب زمینی؛ بیان ژن؛ پروتئین پوششی