بیان ژن تجزیه‌کننده ترکیبات آلی فسفره، opd، در باکتری Escherichia coli
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
کاربرد گسترده ترکیبات آلی فسفره و وجود آنها در اجزای مختلف اکوسیستم منجر به بروز اثرات زیان‌آور زیست‌محیطی بسیاری شده است. استفاده از میکروارگانیسم ها در پالایش این ترکیبات ناگوارد و اندازه‌گیری باقیمانده آفت کش ها به عنوان یک رویکرد دوستدار محیط زیست و مناسب شناخته شده است. هیدرولاز ارگانوفسفره (opd) از آنزیم‌های هیدرولیز کننده فسفو تری استری است که در برخی میکروارگانیسم های خاک به ویژه Flavobacterium sp. شناسایی شده است. این آنزیم طیف گسترده ای از سوبسترا دارد و قادر به هیدرولیز تعدادی از ترکیبات فسفره آلی می باشد. در این پژوهش، بهینه‌سازی کدون‌های توالی رمزگذار این پروتیین برای بیان در باکتری Escherichia coli انجام شد و سپس با حذف توالی نوکلوتیدی رمزگذار پپتید نشانه و جایگزینی اسیدآمینه متیونین به جای سرین به عنوان کدون آغاز، همراه با پروموتر Lac، در وکتور پروموتر-پروب (pTH1705) به صورت ادغام الگوبرداری (transcriptional fusion) کلون گردید. حذف پپتید نشانه امکان بیان پروتیین به صورت محلول را در باکتری تراریخت فراهم می‌آورد. همچنین پروموتر ژن opd نیز برای بررسی کارکرد آن در E. coli در وکتور مورد نظر که دارای چهار پروتین نشانگر GFP، بتا-گلوکوسیداز، RFP و گلوکورونیداز است، کلون شد. در این وکتور ژن‌های GFP و بتا-گلوکوسیداز در یک جهت و ژن‌های RFP و گلوکورونیداز در جهت دیگر مکان کلونینگ وکتور قرار گرفته‌اند و همچنین کدون‌های پایانی برای جلوگیری از بیان ناخواسته پروتیین‌ها در بالادست این ژن‌ها قرار داده شده‌اند. ترانسفورماسیون‌ها در سویه‌های DH5α و XL1-blue (که دارای ژن LacIQ است) باکتری E. coli انجام شدند. برای سنجش عملکرد باکتری تراریخت بیان‌کننده ژن opd (به صورت in trans) از محیط کشت معدنی M9 حاوی غلظت مشخصی از دیازینون با تنظیم منابع کربن و نیتروژن در دسترس استفاده گردید و باکتری تراریخت در آن کشت داده شد. از IPTG جهت القای بیان ژن opd در باکتری تراریخت استفاده گردید. در مرحله‌ی بعدی آزمایش‌های کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به عنوان یک روش استاندارد برای مقایسه با عملکرد باکتری تولید شده استفاده گردید. با بررسی عملکرد باکتری تولید شده در طول زمان، و نمونه برداری از محیط کشت باکتری هر سه روز یک بار مشاهده گردید که در روز پانزدهم غلظت دیازینون از 10 پی پی ام به 8/0 پی پی ام رسید. این نتایج بیانگر انتقال موفق و نیز بیان ژن مورد نظر در باکتری است و این باکتری نوترکیب مهندسی شده مستقیماً توانایی تجزیه‌ی ترکیبات فسفره را داراست. امید است از این باکتری که دارای بیان‌کننده ژن opd ادغام شده با دو نشانگر پروتئینی است، بتوان برای طراحی و ساخت زیست‌حسگر ترکیبات آلی فسفره استفاده نمود.
کلیدواژه ها