جداسازی استرین‌های باکتری جنس .Pantoea sp از معده و مدفوع پروانه برگخوار مرکبات Papilio demoleus (Lepidoptera: papilionidae)
عنوان دوره: بیست و دومین کنگره گیاهپزشکی ایران
نویسندگان
چکیده
طی مطالعه پارامترهای زیستی پروانه برگخوار مرکبات (demoleus Papilio) و به منظور بررسی جدول زندگی، جمعیت اولیه‌ای از این آفت از شهرستان رودسر به دانشگاه گیلان منتقل شد. بعد از یک نسل، پروانه‌ها روی برگ‌های تازه مرکبات از روی سه رقم والنسیا، پرتقال خونی و لیموترش (C. limon, C. sinensis.Var. Valencia, and Citrus paradisi) در شرایط آزمایشگاهی (دمای 2±24 درجه‌ی سانتی گراد، رطوبت نسبی %10±65 و دوره‌ی نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) پرورش داده شدند. بعد از دو هفته علائم بیماری در کلنی لاروهای پرورش داده شده روی رقم والنسیا مشاهده شد. علائم شامل استفراغ سبزرنگ و اسهال و کاهش تغذیه و حرکت بود. هیچ علائمی روی دو رقم دیگر مشاهده نشد. محتوای خارج شده از معده و مدفوع خارج شده از انتهای دستگاه گوارش در لاروهای آلوده روی محیط NA کشت داده شد. در مجموع 32 استرین (RRG1-RRG32) جداسازی گردید. در شناسایی اولیه 10 استرین (RRG1-RRG10) بر اساس ویژگی‌های مورفولوژیکی (کلنی، رنگ، شفافیت، میزان برآمدگی و سطح کلنی) و داده-های بیوشیمیایی (واکنش گرم، رشد در شرایط بی‌هوازی و رشد روی محیط کشت YDC) صورت گرفت. با انتخاب 10 استرین، تست بیماری‌زایی بر روی لاروهای سن سوم پروانه برگخوار مرکبات انجام شد. علائم بیماری تنها در استرین‌های RRG1 تا RRG6 مشاهده شد. مرگ‌ومیر جمعیت لاروی به ترتیب در رقم‌های والنسیا، لیموترش و گریپ‌فروت 94، 36 و 48 درصد مشاهده شد. هم‌بستگی بین مرگ‌ومیر بالای جمعیت لاروی پرورش داده شده روی رقم والنسیا و ظهور علائم بیماری مشاهده شد که ما را به شناسایی استرین-های باکتریایی سوق داد. دو استرین RRG2 و RRG3 جداشده از مدفوع برای شناسایی مولکولی انتخاب شد. ناحیه ی 16s rRNA در دستگاه ترموسایکلر با استفاده از پرایمرهای عمومی F27 (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3') و R1492 (5'TACGGYTACCTTGTTGACTT3') تکثیر گردید. برای واکنش از دستگاه ترموسایکلر (BIORAD) Mj miniTM استفاده شد. هر 25 میکرولیتر محصول واکنش حاوی نیم میکرولیتر از هر پرایمر، دو میکرولیتر نمونه‌ی DNA ژنومی، 5/12 میکرولیتر مسترمیکس (حاوی MgCl2، Polymerase Taq DNA، بافر PCR و DNTPs) و 5/9 میکرولیتر آب دوبار تقطیر بود. قطعات توالی‌یابی‌شده از ناحیه‌ی 16s rRNA ایزوله‌های دو و سه با توالی های معتبر قابل دسترس در بانک ژن (NCBI) مقایسه گردید؛ مجموعه اطلاعات توالی‌ها با استفاده از نرم‌افزار CLUSTALW تدوین و با دیگر توالی‌های موجود در بانک ژن مقایسه گردید. استرین-های انتخابی با شباهت 99 تا 100 درصدی به جنس Pantoea sp. تعلق داشتند (ثبت با شماررسKX356315-16 در بانک ژن). همچنین تست بیماری‌زایی لارو سن سوم دو حشره‌ی دیگر شامل زنبور برگخوار ثانوی رز (Allantus viennensis) و کرم غوزه پنبه (Helicoverpa armigera) صورت گرفت و علام تقریباً مشابهی ظهور یافت که حاکی از ارتباط بین جنس .Pantoea sp و حشرات آلوده شده است. این اولین گزارش جداسازی .Pantoea sp از پروانه‌ی برگخوار مرکبات در ایران است.
کلیدواژه ها